猴痘是一種由猴痘病毒（MPVX）感染的病毒性人畜共患疾病。MPVX屬于痘病毒科正痘病毒屬，為基因組全長約197 kb的雙鏈DNA病毒。感染猴痘病毒后，患者一般會出現(xiàn)高燒，頭痛，背部疼痛，肌肉疼痛，淋巴結(jié)腫大，皮疹等癥狀。自2022年5月7日在英國診斷出一例MPVX病例以來，相繼在世界各地出現(xiàn)患者，患病人數(shù)呈上升趨勢。2023年9月15日，國家衛(wèi)生健康委發(fā)布公告，自2023年9月20日起將猴痘納入乙類傳染病進(jìn)行管理，采取乙類傳染病的預(yù)防、控制措施。
猴痘病毒的暴發(fā)引起社會各界廣泛關(guān)注，qPCR檢測技術(shù)是目前檢測猴痘病毒的唯一金標(biāo)準(zhǔn)，但其需要特定的儀器和環(huán)境，故，亟待出現(xiàn)一種可以在資源貧乏環(huán)境中應(yīng)用的快速檢測方法。安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和安徽省公共衛(wèi)生臨床中心共同在題為“Creating an ultra‐sensitive detection platform for monkeypox virus DNA based on CRISPR technology”的文章中報道了一種基于CRISPR技術(shù)開發(fā)的猴痘病毒DNA超靈敏檢測平臺，利用Cas12a酶和Cas13a酶的切割特性進(jìn)行雙靶標(biāo)檢測，MPXV基因組最低檢出限為10⁰ copies/μL，且特異性高，與其他痘科病毒、假病毒和細(xì)菌無交叉反應(yīng)性。

01、方法建立

在本研究中作者設(shè)立了兩步法和一管法兩種檢測方法（圖1）。兩步法檢測：采集MPVX病人樣本，RPA反應(yīng)后取部分反應(yīng)液至CRISPR雙重反應(yīng)體系中，Cas12a/crRNA復(fù)合物識別出DNA產(chǎn)物中F3L基因，被激發(fā)出反式剪切活性，使FAM標(biāo)記的ssDNA探針斷裂，釋放FAM熒光信號。另一邊Cas13a系統(tǒng)靶向的B6R基因通過T7體外轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)換為RNA靶標(biāo)，激活Cas13a/crRNA復(fù)合物的反式剪切活性，導(dǎo)致ROX標(biāo)記的ssRNA探針斷裂，釋放ROX熒光信號。如果使用試紙條層析進(jìn)行該實驗，則可以通過顏色變化直觀檢測出是否感染MPVX病毒。

一管法檢測即先在PCR管底部進(jìn)行多重RPA反應(yīng)，CRISPR反應(yīng)體系放在PCR管蓋上，等PCR管底部RPA反應(yīng)結(jié)束后，通過短暫離心使CRISPR反應(yīng)體系掉落到管中繼續(xù)進(jìn)行反應(yīng)。檢測結(jié)果同樣可以通過熒光信號進(jìn)行判斷。

                                        圖1.基于CRISPR雙系統(tǒng)建立MPXV檢測平臺
02、CRISPR雙系統(tǒng)的優(yōu)化及建立

作者首先對CRISPR系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，驗證了Cas12a對F3L基因的識別，并優(yōu)化了不同濃度下Cas12a/crRNA對F3L的切割效率（圖2A），建立了單管反應(yīng)下CRISPR體系和RPA試劑最優(yōu)反應(yīng)體積（圖2B）。與此同時，優(yōu)化Cas13a/crRNA的體系對B6R基因的識別，明確體系中NTP mix為5 mM，T7 RNA聚合酶為4 U/μL時最優(yōu)（圖2C，2D）。最后，針對優(yōu)化前后的體系進(jìn)行對比驗證（圖2E，2F）。

                             圖2.CRISPR雙系統(tǒng)優(yōu)化

為建立雙重CRISPR系統(tǒng)檢測F3L和B6R基因，分別設(shè)計了FAM‐ssDNA‐BHQ1和 ROX‐ssRNA‐BHQ2探針，并通過實驗驗證在兩步法和一管法中均可以檢測出較強的熒光信號，二者具有良好的正交性（圖3）。

                                                  圖3.雙重CRISPR檢測系統(tǒng)的建立

03、靈敏度和特異性評估

研究者單獨對兩步法中F3L和B6R基因檢測，其檢測下限為10⁰ copies/μL（圖4A，4B）。一管法中Cas12a靶向的F3L基因檢測下限在10² copies/μL（圖4C），Cas13a靶向的B6R基因檢測下限在10⁰ copies/μL（圖4D）。隨后對兩種方法中的兩種基因同時檢測，發(fā)現(xiàn)檢測下限與之前一致（圖4E，4F）。在特異性評估中其特異性良好，無交叉反應(yīng)（圖4G）。

                                                                 圖4.靈敏度和特異性評估
04、化學(xué)添加劑對一管法靈敏度提升

為解決Cas12a檢測F3L基因一管法檢測限比兩步法高出2個數(shù)量級的問題，作者希望提升一管法檢測的靈敏度。作者通過添加L -脯氨酸、尿素、甜菜堿、甘油和DMSO摸索其對Cas12a剪切的影響。在Cas12a剪切濃度為10⁵ copies/μL的樣本時，加入化學(xué)添加劑，發(fā)現(xiàn)，0.1 mM L -脯氨酸、0.1 mM尿素、5%甘油對熒光信號有較好的提升作用（圖5A，5B）。隨后，在體系中補充BSA，對熒光信號值亦有提升（圖5C，5D）。綜合上述情況，作者同時添加了5%甘油和BSA，在10¹ and 10⁰ copies/μL體系下可檢測出強熒光信號，并與兩步法進(jìn)行對比。最終，兩者方法檢出下限一致（圖5E，5F）。作者將F3L和B6R基因檢測下限與qPCR進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)加入化學(xué)添加劑優(yōu)化后的CRISPR體系可達(dá)到與qPCR一致的檢測靈敏度（圖5G）。

圖5.化學(xué)添加劑對一管法靈敏度的提升

05、試紙條層析實現(xiàn)可視化檢測

為在試紙條上實現(xiàn)MPVX檢測，根據(jù)試紙條層析的反應(yīng)原理（圖6A），分別設(shè)計了FAM-ssDNA‐Biotin和Dig‐ssRNA‐Biotin兩條探針用于檢測F3L和B6R基因，并調(diào)整相關(guān)實驗體系，使Cas12a對F3L基因的檢測靈敏度在10¹ copies/μL，Cas13a對B6R基因的檢測靈敏度在10⁰ copies/μL（圖6B-6E），同時，確保不出現(xiàn)假陽性結(jié)果，進(jìn)行了特異性驗證（圖6F）。

圖6.試紙條層析可視化檢測

06、臨床模擬陽性樣本驗證

作者采集模擬了臨床病人不同類型的陽性樣本，通過采集熒光信號和試紙條層析兩種方法分別對8例陽性病人樣本進(jìn)行驗證（圖7A，7B），結(jié)果與qPCR一致（圖7C）。說明建立的CRISPR雙重檢測系統(tǒng)可以檢測MPVX臨床樣本。

 圖7.臨床模擬陽性樣本驗證

總結(jié)

本研究工作中作者通過建立雙重CRISPR系統(tǒng)檢測，利用Cas12a酶和Cas13a酶的切割特性進(jìn)行雙靶標(biāo)檢測，將MPXV的F3L和B6R基因最低檢出限控制在10⁰ copies/μL、并實現(xiàn)了試紙條層析可視化快速檢測。該簡便、高靈敏的檢測方法為貧困、條件艱苦地區(qū)進(jìn)行猴痘病毒快速POCT檢測提供了可能。相關(guān)產(chǎn)品

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