活化細胞的機制——用于流式檢測PMA&Ionomycin

       流式胞內(nèi)染色中最常用的活化細胞方法就是用一定濃度的PMA和Ionomycin刺激細胞4-6小時，同時加入蛋白轉運抑制劑（通常是monensin或brefeldin A）阻止高爾基體將新分泌蛋白運輸?shù)郊毎?，從而達到通過流式來檢測細胞因子的目的。今天，就來簡單的聊一聊PMA和Ionomycin刺激細胞活化的機制。

       離子霉素是一種有效且有選擇性的鈣離子載體試劑 (1,2)。這種分子作為能動 Ca2+ 載體發(fā)揮作用，并通過直接刺激存儲調(diào)節(jié)的陽離子進入生物膜增強 Ca2+ 內(nèi)流 (3)。微摩爾水平的離子霉素會激活 Ca2+/鈣調(diào)素依賴的激酶和磷酸酶來刺激基因表達 (4)。在人 T 細胞中，離子霉素會誘導磷酸肌醇水解，并激活 PKC 以介導 T 細胞激活 (5)。人 B 細胞用離子霉素處理會誘導鈣依賴性核酸內(nèi)切酶的激活，并導致細胞凋亡 (6)。牛主動脈內(nèi)皮細胞 (BAEC) 用離子霉素處理會誘導 eNOS 在Thr495位點的快速去磷酸化，并介導 eNOS 激活 (7)。常常與佛波肉荳蔻醋酸PMA聯(lián)合刺激多種免疫細胞，以產(chǎn)生細胞因子。同時也與蛋白轉運抑制劑如布雷非德菌素A（Brefeldin A），莫能霉素（Monensin）聯(lián)合使用，抑制細胞因子外分泌，保留在細胞內(nèi)以準確分析細胞因子表達水平。

      Phorbol 12-myristate 13-acetate( 佛波肉豆蔻醋酸) ，簡稱為PMA 也稱為TPA CAS NO 16561-29-8，一種廣泛用于體內(nèi)外實驗的佛波酯(phorbol ester )類PKC激舌劑。PMA可抑制Fas誘導的細胞凋亡，同時又可誘導HL-60細胞的周亡發(fā)生。PMA是一種強效的腫瘤促進劑能夠誘導小鼠皮膚瘤生成。常常與離子霉素Ionomycin ( 貨號WU074 )聯(lián)合刺激多種免疫細胞，以產(chǎn)生細胞因子。同時也與蛋白轉運抑制劑如布雷非德菌素A( Brefeldin A ,貨號WU045) ,莫能霉素( Monensin 貨號: WU057) 聯(lián)合使用抑制細胞因子外分泌，保留在細胞內(nèi)以準確分析細胞因子表達水平。

       激活Protein kinase C (PKC)
在細胞內(nèi)，Protein kinase C (PKC)的激活，可以引起下游眾多蛋白激酶的磷酸化，形成級聯(lián)反應，導致多種蛋白的表達，進而引起細胞的活化。PKC可以在DAG(二脂酰甘油)和Calcium（Ca2+）的共同作用下而激活。PMA是一種DAG的模擬物，而Ionomycin是Ca2+的轉運劑，可將細胞器內(nèi)的Ca2+轉運到胞漿，所以PMA和Ionomycin的共同作用可以激活PKC，從而引起一系列的下游反應。
PMA的中文名稱是豆蔻酰佛波醇乙酯（也稱TPA），英文全稱是： Phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA)，或12-O-Tetradecanoylphorbol 13-acetate(TPA)，是一種最常用的佛波酯(phorbol ester)，
Ionomycin
Ca2+在細胞內(nèi)普遍存在，控制著細胞內(nèi)很多生物過程，包括細胞增殖、分化、分泌細胞因子等，這些生物過程的發(fā)生和細胞內(nèi)的Ca2+濃度密切相關（如下圖所示）。離子霉素（Ionomycin）作為一種鈣離子載體，可提高胞漿內(nèi)游離Ca2+的水平，活化依賴Ca2+/鈣調(diào)蛋白生物途徑。所以，如前面所說PMA和Ionomycin的共同作用可以起到激活細胞的作用。
PMA&Ionomycin與流式檢測

1.PKC屬于下游的TCR信號，只會誘導T細胞活化和增殖，因此，PMA和Ionomycin的刺激后T細胞的活化和增殖能力改變，然而并不會改變T細胞的分化狀態(tài)。

2.TCR信號的活化會激活所有的T細胞亞群，所以當T細胞不同亞群的增殖速率不一樣時，各個T細胞亞群的原始比例就會因為刺激而發(fā)生改變。但是這種假說很難加以證明，因為在沒有刺激的情況下，胞內(nèi)因子很難被檢測到。

3。因為TCR信號是很強很基礎的刺激，研究者更加傾向于認為所有的T細胞亞群在TCR信號刺激下的增殖速度是一致的，所以在在體外進行PMA和Ionomycin刺激后，仍然反映的是T細胞亞群在生物體體內(nèi)的原始比例。
了解了PMA和Ionomycin刺激細胞活化的機制，再來探討流式胞內(nèi)染色中如何合理的使用刺激劑對細胞進行刺激，已達到檢測目的。對于小鼠的淋巴細胞或人的PBMC樣本中的一些胞內(nèi)因子（如IFN-γ、IL-2、TNF-α等），直接用PMA和Ionomycin刺激培養(yǎng)一段時間后，就可以用流式胞內(nèi)染色的方法進行檢測。但是對于有一些細胞因子，比如mouse的IL-4等，正常情況下直接用PMA和Ionomycin刺激培養(yǎng)4-6小時后是很難檢測到IL-4的信號，對于這些胞內(nèi)因子的檢測是需要實驗人員設計合理的刺激方案進行刺激。關于檢測不同胞內(nèi)因子的刺激方案。

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